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LZCap®AG Capping Kit (N1-Me-pUTP)
- 产品货号:HN4002/HN4003

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l  产品介绍

LZCap® mRNA共转录加帽及纯化试剂盒,用于在体外共转录合成含有Cap1结构的mRNA,核心组分LZCap® AG是一种Cap1类似物,在T7聚合酶作用下以共转录的方式合成到mRNA的5’端。试剂盒内包含了DNase I和LiCl,用于mRNA纯化。

共转录加帽纯化后的mRNA能在细胞和体内翻译表达,广泛应用于体外转录、基因编辑、疫苗研发、CAR-T治疗、蛋白代替疗法以及再生医学等领域。

  产品规格:

50次/盒(20μL体系);200次/盒(20μL体系);产品货号:HN4002-200T/ HN4003-200T

规格及组份:50次/盒(20μL体系);200次/盒(20μL体系)

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保  存:低于-20°C保存。

l  DNA模板设计

本试剂盒以LZCap® AG为核心,适用于AG起始的序列,如下图所示,T7启动子(下划线标识部分)后接AG序列能够有效起始转录。

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l  实验流程

1.     参考产品组份表室温配置转录体系;

    2. 将配置好的反应液混匀,短暂离心后,置于37℃孵育2-3小时,若转录本长度小于100nt,增加反应时间至4-8h;

    3. 反应结束后,各管再加入1μL的DNase I,37℃反应15min,消化DNA模板;

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注:为进一步降低mRNA的免疫原性,可选用澳门新葡澳京官网修饰核苷酸N1-Me-pUTP(N1-甲基假尿苷三磷酸)(货号:HN1002)单品用来代替UTP参与转录反应。也可以直接选用HN4003试剂盒。

   4. LiCl沉淀法纯化

1)反应后20μL的转录产物内分别加入30μL的LiCl和30μL RNase Free Water(LiCl终浓度需保持在2.5-2.8M),混匀后放入-20℃沉淀至少0.5h;

2)取出沉淀后产物,12000rpm离心15min,去除上清液,保留沉淀;

3)加入预冷的75%乙醇600μL清洗,12000rpm离心8min,去除上清;

4)再重复2次步骤3,共清洗3次;

5)放超净台静置10min至乙醇完全挥发,用30-100μL RNase Free Water溶解RNA沉淀,即获得纯化后的目标mRNA。

l  注意事项

1. LZ Cap® AG适用于以5’AG起始序列的T7启动子转录载体,在载体构建时需要加以考虑。

2. 实验所用的试剂耗材和容器等无RNase污染。

3. 建议使用线性化的DNA模板进行转录,每个反应中可加1μg;若使用PCR产物作为转录起始模板,可加0.1μg~1μg;合成的DNA模板,可加0.1μg~0.5μg。

4. 使用修饰核苷酸代替野生型核苷酸时,反应终浓度不变。

5. 由于10×Buffer浓度偏高,高盐环境会导致聚合酶失活,同时buffer中含有成分,会与模板DNA形成沉淀,配制反应液时需调整组分加样顺序,计算好体系,先加水,然后加buffer,NTP,最后加模板和酶,以防止10×的高浓度盐离子对酶造成影响。